| 
 | 
 | 
                    
 | 
 

Коэффициент эллиптичности и толщина оболочек микроорганизмов

Назад

 

В настоящей статье мы продолжаем делиться материалами, предоставленными разработчиками программы 3Д-Динофлагеллята 2.0.

 

Сегодня поговорим о коэффициенте эллиптичности, о его связи с объемами и площадями поверхности организмов, о методах измерения толщины – третьего скрытого размера оболочек микроорганизмов, и о способах обработки массивов размеров.


 

 

Коэффициент эллиптичности


Коэффициент эллиптичности – это число, которое показывает, как сильно сплющена оболочка микроорганизма. Фактически – это отношение толщины оболочки к ширине. Обозначается латинским k.

k = толщина / ширина.

Считается, что толщина микроводоросли не больше ширины, поэтому k не бывает больше единицы.

толщина ≤ ширина, ⇒ 0 < k ≤ 1.


Чем меньше коэффициент, тем больше сплющена оболочка



Коэффициент равный единице характеризует круглый в продольном сечении организм. Чем меньше коэффициент, тем больше сплющена оболочка. Так коэффициент ½ описывает организм, у которого ширина оболочки в два раза больше толщины. Нулевой коэффициент невозможен, так как он определяет плоский организм.

 

Назначение коэффициента эллиптичности

Когда известен коэффициент эллиптичности, измерение толщины становиться не нужным, так как толщина вычисляется по формуле:

mолщина ширина k.

Вот так рассчитывается ширина:

ширина = толщина / k.

В этом заключается удобство коэффициента.

 

 

Синонимичные названия коэффициента эллиптичности

Название коэффициента эллиптичности связано с эллипсом. Степень отклонения эллипса от окружности называется эксцентриситетом. Но это другая характеристика.

В отечественной печати значения коэффициента, по-видимому, впервые появились в работах Юли Брянцевой и коллег (2003; 2005). Здесь коэффициент были назван поправочным коэффициентом и коэффициентом уплощения, потому что он характеризует уплощенность или сплющенность микроорганизмов.

В англоязычных работах говорят о третьем скрытом размере (англ. thirdhidden dimension), глубине организма (англ. depth) или коэффициенте пропорциональности (англ. aspect ratio).

Смотрите, например:

 

 

Круглые и эллиптические модели оболочек

Толщина, ширина и высота – это три основных размера, которые используются для определения объема и площади поверхности организмов.

Толщину микроводоросли игнорируют, когда скорость обработки пробы важнее точности результатов. Тогда толщину считают равной ширине и форму микроводорослей аппроксимируют круглыми геометрическими моделями: шаром, сфероидом, круглым цилиндром и конусом. Многие альгологи пользуются круглыми моделями, чтобы сократить количество измерений.

Толщину микроводоросли измеряют, когда важно воссоздать сплющенную форму оболочки организма. В этом случае применяют эллиптические модели:эллипсоид, эллиптический цилиндр и эллиптический конус. Здесь поперечное сечение модели – это эллипс. Вычисление объема и площади поверхности эллиптических моделей сложнее круглых, а измерения более трудоемки, но результаты расчетов получаются более правдоподобными.


Вычисления объема и поверхности эллиптических моделей сложны, но результаты более правдоподобны



Организмы тоже бывают круглыми или эллиптическими. Коэффициент эллиптичности помогает определить объем и площадь поверхности эллиптических организмов.

 

 

Связь коэффициента эллиптичности с объемом и площадью поверхности организма

Отношение объема круглого организма (V) к объему такого же по размеру эллиптического организма (Vk) равно коэффициенту эллиптичности:

V приплюснутого организмаV круглого организмаk.

Другими словами объемы одноразмерных организмов, отличающихся толщиной, линейно зависят от коэффициента эллиптичности.

Эта простая формула позволяет эффективно трансформировать архивные данные об индивидуальных объемах круглых микроводорослей в индивидуальные объемы сплюснутых микроводорослей. Для этого достаточно умножить значения исходных объемов на коэффициент эллиптичности.

С площадями поверхностей сложнее. Их отношение описывается степенным уравнением с двумя параметрами a и p:

A приплюснутого организмаA круглого организмаa (1 + kp).

Значения параметров индивидуальны – они определяются формой и размерами организмов.

Графики зависимости отношения площадей поверхностей от коэффициента эллиптичности у организмов разной формы и размеров. Красная кривая в среднем аппроксимирует все отношения.

 

 

Уравнение, которое в среднем описывает все отношения, выглядит так:

AkA = (1 + k3/2) / 2.

На графике – это красная кривая. Ее недостаток – чем меньше коэффициент эллиптичности, тем больше вероятность отклонения средней кривой от реального отношения поверхностей.

 


Объем линейно зависит от коэффициента эллиптичности, а площадь поверхности нет



Таким образом, зная коэффициент эллиптичности, мы можем определить толщину организма и по значению объема круглого организма вычислить объем сплюснутого организма. По значению площади поверхности круглого организма можно приближенно найти площадь поверхности сплюснутого организма. Если вам нужны точные значения площади поверхности, вычисляйте, используя размеры.

Определяем толщину микроводоросли

На предметном стекле микроводоросль обычно ложится широкой стороной к наблюдателю: видны ее длина и ширина, а толщина нет. По этой причине толщину часто называют третьим скрытым размером. Скрыт может быть любой размер – все зависит от ориентации микроводоросли. Рассмотренные ниже методы измерения толщины и методы обработки полученных данных применимы для любого размера любого микроорганизма. Замените толщину на высоту и используйте те же методы.


Замените толщину на другой размер и используйте те же методы


Важно в процессе измерений не потерять ценную морфометрическую информацию, поэтому всегда вместе с толщиной измеряйте один или два оставшихся размера (ширину или высоту) и записывайте эти значения. Они понадобятся, когда вы будете обрабатывать данные.

Толщину измерют следующими методами.

Используют среднее значение, полагая, что у всех организмов одного вида одинаковая толщина, например, равная ширине. Это самый простой, самый быстрый и самый неточный подход. Его часто применяют при автоматизированной обработке проб фитопланктона с помощью проточной цитометр

ии.

Ищут организмы того же вида, расположенные другой стороной: боком, верхом или низом к наблюдателю. Измеряют их толщину и второй видимый размер: ширину – если организм виден сверху или снизу, или высоту – если организм виден сбоку. (Иногда аккуратным постукиванием иголочкой по предметному стеклу можно добиться поворота микроорганизма.)

 

Динофитовые водоросли Ceratium tripos и Ceratium furca с разных сторон.

 


Используют микровинт оптического микроскопа. Фокусируются на верхней точке оболочки организма, засекают показания микровинта, затем фокусируются на нижней точке оболочки организма и также фиксируют показания микровинта. Разница в показаниях дает приближенную величину третьего размера.

 

В фокусе микроскопа верхняя створка, центр панциря и нижняя створка диатомовойLyrella sp.

 

 

Метод применяют для относительно крупных микроорганизмов размером от нескольких десятков микрон, у которых верхняя и нижняя поверхности оболочки покрыты четкой текстурой. Например для диатомовых или силикофлагеллят (Mccartney & Loper, 1989). Метод субъективен, результаты измерений сильно зависят от качества оптического оборудования и навыков исследователя.

Используют конфокальный микроскоп. С его помощью фотографируют организм с разной глубиной резкости, как бы нарезая его на кусочки. Полученную последовательность фотографий (стек) обрабатывают в программе, которая создает трехмерную модель организма. В программе измеряют трехмерную модель и получают значения размеров, объема или площади поверхности организма. Таким методом Roselli с сотоварищами(2013) измеряли клетки центричной диатомовой Coscinodiscus cf. granii,нарезая их в среднем на 114 частей.

 

3Д-модель Coscinodiscus cf. granii созданная из стека фотографий (по Roselli и др., 2013 с исправлениями)

 

 

Для измерения скрытого размера достаточно, как и в предыдущем способе, сфокусироваться на верхней и нижней точках поверхности оболочки организма. Так как конфокальный микроскоп позволяет получить более резкие изображения чем оптический, то результаты измерения толщины тоже будут точнее. Недостаток метода – необходимость покупки дорогостоящего микроскопа.

Используют электронный стереомикроскоп для получения пары фотографий, на которых один и тот же объект виден под двумя разными углами. На фотографиях выбирают реперные точки, определяют их местоположение в плоскости фотографии и преобразуют измеренные величины в расстояния между точками в пространстве объекта.

 

Стереоизображение кремниевых шариков и данные для определения расстояния между ними (автор Jining Xie)

 

 

Метод трудоемкий. Необходим электронный стереомикроскоп и усердие для подготовки пробы, фотографирования и измерения положения реперных точек.

Используют сканирующий зондовый микроскоп (атомно-силовой) для изучения топографии образца и измерения микрообъектов. Для измерений применяется микромеханический зонд – кантилевер – острозаточенную иглу, которая движется по поверхности пробы. Микронеровности поверхности вызывают отклонения иглы, регистрируемые компьютером, который создает топографическую карту поверхности. При горизонтальном движении кантилевер отклоняется немного раньше границы объекта, вследствие чего горизонтальные размеры организмов получаются завышенными (Nishino и др., 2004), а вертикальные определяются правильно.

 

Рельефное изображение створок пеннатных диатомовых, полученные при помощи атомно-силового микроскопа (АСМ); оси позволяют найти высоту створок (автор Almqvist  и др., 2001)


 


Поверхность створок диатомовой Coscinodiscus sp.: (A) изображение поверхности полученное с помощью АСМ, (B) рельеф поверхности вдоль отрезка прямой, (C) та же поверхность под электронным микроскопом (автор Dusan Losic и др., 2007)

 


АСМ применяется для изучения бактерий (Nishino и др., 2004; Malfatti и др., 2010) и поверхности панцирей диатомовых (Almqvist  и др., 2001; Losic и др., 2007). АСМ позволяет исследовать поверхность микроорганизма с очень высоким разрешением (от десятков ангстрем до атомарного), но c его помощью нельзя увидеть исследуемый объект в оптическом диапазоне (это позволяет сделать ближнепольный оптический микроскоп). Кроме того исследуемая площадка имеет крошечный размер – 150×150 микрон².

 

Используют ранее полученные данные, свои или чужие, опубликованные или находящиеся в открытом доступе. К сожалению таких данных очень мало. Мне известны две работы, в которых приведены коэффициенты, позволяющие найти третий скрытый размер микроводорослей. Это работа Юлии Брянцевой и др. 2005 года о вычислении объемов и поверхностей микроводорослей Черного моря и публикация Хельсинской комиссии № 106 об объемах и размерных классах фитопланктона Балтийского моря. Для других водоемов таких данных нет. Надо учиться у ребят с Балтики, они здорово организовали свои исследования и регулярно публикуют в открытом доступе разнообразные материалы.

 

 

Обработка данных о толщине организмов


Вы измерили скрытые и видимые размеры организмов. В результате у вас получились массивы значений толщины и ширины. Эти данные нужно обработать, сохранить в базе данных (например в таблице Эксель) и потом использовать для вычисления объемов и поверхностей организмов. Ниже предложено четыре способа обработки данных, описаны их достоинства и недостатки. Для иллюстрации использованы искусственные данные о ширине и толщине четырех гипотетических популяций микроводорослей.

Ширина (по горизонтали) и толщина (по вертикали) четырех гипотетических популяций микроводорослей.

 


Способ 1. Средняя толщина

Предполагаем. У всех организмов одного вида одинаковая толщина.

Алгоритм. Находим среднее значение толщины и используем его для всех организмов этого вида.

Преимущества. Минимум измерений и вычислений.

Недостатки. Не учитывается естественная вариабельность размеров организмов, поэтому результаты оценок объемов и площадей поверхности будут приблизительными.

Проверка. Помимо средней толщины вычислите коэффициент вариации (CV, %). Если получится, что коэффициент вариации небольшой (CV < 5%), используйте среднее значение толщины – вы статистически показали, что организмы сохраняют пропорции и толщина оболочки практически не изменяется. В противном случае предположение о постоянной толщине будет неверным, следовательно вычисленные результаты будут существенно отличаться от реальных.

 

Среднее значение толщины во всех случаях отвратительно характеризует изменчивость размера.

 

 

Способ 2. Средний коэффициент пропорциональности.

Предполагаем. У всех организмов одного вида одинаковые пропорции, следовательно отношение толщины оболочки к ширине неизменно.

Алгоритм. Вычисляем отношение толщины к ширине и определяем среднее от полученных величин. Это будет средний коэффициент пропорциональности. Используйте его для расчета толщины оболочек организмов.

Преимущества. Намного лучше, чем среднее значение, так как здесь используется линейная взаимосвязь между двумя размерами.

Недостатки. Не учитывается естественная вариабельность пропорций организмов.

Проверка. Вычислите коэффициент вариации. Если он небольшой, то пропорции организмов остаются практически неизменными и можно пользоваться средним значением коэффициента.

Комментарий. Коэффициент пропорциональности – синоним коэффициента эллиптичности и частный случай линейного уравнения регрессии, в котором свободный член равен нулю.

 

Средний коэффициент пропорциональности в первом случае не характеризует разброс данных; в  остальных трех – он хорошо описывает изменчивость размеров.

 

 

Способ 3. Уравнение регрессии.

Предполагаем: толщина оболочки организма зависит от ширины и эта зависимость выражается уравнением.

Алгоритм. Определите параметры уравнения регрессии (не обязательно линейной), которое наилучшим образом описывает зависимость между толщиной и шириной.

Преимущества. Возможность описывать нелинейные закономерности изменения толщины: квадратичные, экспоненциальные, сигмоидальные.

Недостатки. Можно увлечься игрой с уравнениями высоких порядков, которые станут оторванными от законов биологии.

Проверка. Значение r2 уравнения регрессии.

Уравнения регрессии. В первом случае найденная линейная закономерность притянута к данным за уши. Во втором – линейное уравнение регрессии фактически совпало со средним коэффициентом пропорциональности. В третьем и четвертом случаях отрезок параболы (квадратное уравнение) отлично описывает законы изменения размеров микроводорослей.

 

 

Способ 4. Размерные классы.

Предполагаем: организмы определенного размера (из одного размерного класса) имеют одинаковую закономерность изменения толщины оболочки.

Алгоритм. Выделяем (визуально или математически) однотипные участки графика и определяем уравнение (линейной) регрессии, наилучшим образом описывающее данные на каждом из участков.

Преимущества. Сложные уравнения изменения толщины заменяются несколькими простыми линейными уравнениями.

Недостатки. Могут возникнуть трудности с выбором диапазонов. Иногда закономерности выделенные для размерных классов работают хуже, чем единая закономерность для целой совокупности данных.

Комментарий. Границы размерных классов стараются выбрать кратными 5 или 10, но иногда лучше срабатывают неравномерные диапазоны, выделенные путем анализа данных.

 

В двух первых популяциях размерные классы организмов не выделены. В двух последних популяциях выделено два размерных класса организмов, в каждом классе толщина линейно зависит от ширины.


Заключение


Мы начали разговор с коэффициента эллиптичности – отношения толщины к ширине организма, выяснили, как его использовать для быстрого определения объемов сплюснутых организмов, рассмотрели способы определения толщины организмов и обработки полученных данных. Оказалось, что иногда вместо среднего значения коэффициента эллиптичности лучше искать нелинейные зависимости между толщиной и шириной организмов или линейные зависимости для размерных классов организмов.

В целом, если у вас есть большой массив значений толщины, а по сути любого из размеров, отобразите эти значения на графике и посмотрите, как ведет себя облако точек. Визуальный осмотр подскажет вам, как обрабатывать данные. Обязательно сохраните исходные данные и найденные закономерности.

В следующий раз рассказ об измерении микроводорослей по фотографиям.

Жду ваших отзывов по адресу  Этот e-mail адрес защищен от спам-ботов, для его просмотра у Вас должен быть включен Javascript

 


P.S. Я впервые познакомился с коэффициентом эллиптичности в работах Юли Брянцевой. Юля нашла коэффициенты эллиптичности многих видов черноморских микроводорослей и опубликовала руководство. Впоследствии Юля и Наталья Дерезюк рассчитали значения коэффициентов эллиптичности оболочек черноморских динофлагеллят, которые сейчас используются в программе «3Д-Динофлагеллята».

Я выражаю свою благодарность Юлии Брянцевой и Наталии Дерезюк за возможность использовать результаты их кропотливого труда, и призываю всех, также, как Юлия и Наталия, давать возможность другим исследователям пользоваться вашими данными о размерах организмов. Ведь это очень важно и для вас, и для ваших коллег и для науки.

P.P.S. Графики построены в программе СигмаПлот.

 

Источник: http://3d-microalgae.org

  • PDF
Баннер